결정 번호 04/2004/QĐ-BTS에 의한 업종 표준 발포에 관한 결정

결정

산업 표준 발포에 관하여

 

수산부 장관

정부가 2003년 5월 2일 제정한 43/2003/NĐ-CP 호치민 시 정부 규정에 의거하여 수산부의 기능, 임무, 권한 및 조직 구성을 규정함;

과학기술과 장관의 제안에 따라

 

결정함에 있어서:

조 1. 다음의 산업 표준을 제정함:

28 TCN 202: 2004 페나이드 굴虾属种类病毒白斑病聚合酶链反应诊断程序

조 2. 위 표준은 전국 범위 내에서 수산병 검사 및 검증 기관에게 권장되며, 공보에 게재된 날로부터 15일 후부터 효력이 발생한다.

조 3. 수산부 사무총장; 수산부 각 부, 국, 감찰부 장관; 수산부 소속 단위 장관; 수산 부서를 관리하는 농업 및 농촌 발전 소장; 제2조에 명시된 수산병 검사 및 검증 기관과 관련된 다른 단위는 본 결정을 이행할 책임이 있다.

                                                28 TCN202:2004:

POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD FOR DIAGNOSING WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN PENAEID SHRIMP SPECIES
                                            1. 1 본 절차는 페나이드 굴虾属种类聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법을 사용하여 흰 반점 증후군 바이러스(White Spot Syndrome Virus, WSSV)를 검출하는 절차와 내용을 규정한다.

1. 적용 대상 및 범위

1. 2 본 절차는 페나이드 굴虾属种类亲虾、种虾和养殖商品虾的病毒白斑病进行诊断，使用聚合酶链反应技术。该程序也可用于其他甲壳类动物的病毒白斑病诊断。

2. 1 Lightner D.V. (Ed.) (1996). Handbook of Pathology and Diagnostic Procedures for Diseases of Penaeid Shrimp. World Aquaculture Society, Baton Rouge, USA.

2. 2 Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F., Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). White spot syndrome baculovirus (WSBV) detected in cultured and captured shrimps, crabs and other arthropods. Dis. Aquat. Org., 27, 215-225.

2. 3 Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y., Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). Detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Org., 25, 133-141.

2. 4 Newton C.R. and Graham A. (1994). PCR. The Alden ss Ltd, Oxford, UK.

3 용어 해석 본 절차에서 다음과 같은 용어들은 다음과 같이 이해된다:

3. 1 Polymerase chain reaction (PCR) technique은 DNA 목표 서열의 복제본 수를 확대하기 위해 연속적인 반응 과정을 사용하는 기술로, 변성, 결합, 그리고 새로운 DNA 서열의 합성을 포함하는 세 가지 단계로 구성된다.

3. 2 DNA polymerase는 DNA 서열의 새로운 체인을 생성하는 효소로, DNA 복제 과정에 참여할 수 있다.

3. 3 bp (base pair)는 DNA 이중 체인에서 A-T 또는 C-G 쌍으로 구성된 단위이며, DNA 분자의 길이를 측정하는 단위이다.

3. 4 Primer는 DNA 서열의 일부분으로, 자유롭게 3'-OH 끝을 가진 DNA 체인에 결합하여 DNA polymerase가 새로운 체인을 생성하도록 도와주는 역할을 한다.

3. 5 상방 프라이머와 하방 프라이머는 역전사 방향에 따라 이해된다.

3. 6 Denaturation은 DNA가 이중 체인에서 단일 체인으로 분리되는 과정으로, 주로 열을 이용한다.

3. 7 굴의 필름은 여러 필름 선들이 모여 이루어진 구조로, 각 필름 선은 호흡 기능을 하는 세포들로 구성되어 있다.

4 장비, 도구, 프라이머 및 화학물질

4. 1 장비, 도구

4. 1.1 무균 샘플 분쇄기.

4. 1.2 샘플 혼합기.

4. 1.3 자기 유동 혼합기.

4. 1.4 증류기.

4. 1.5 회전식 센트리프UGE (최소 속도 13,000 rpm 이상).

4. 1.6 온도 조절기.

4. 1.7 전기 이동 시스템 (전원 및 횡단 전기 이동 용기).

4. 1.8 UV 광선 302 nm를 사용한 결과 판독 테이블.

4. 1.9 결과 저장을 위한 사진 촬영 장치.

4. 1.10 -20°C 또는 그 이하의 온도를 유지하는 냉장고.

4. 1.11 4°C의 온도를 유지하는 냉장고.

4. 1.12 무균 작업용 냉장고.

4. 1.13 도구 건조기.

4. 1.14 마이크로파 오븐.

4. 1.15 분석 척도 (정밀도 0.001g).

4. 1.16 다양한 종류의 마이크로 피펫: 1-5, 5-10, 20-100, 100-1000 ml.

4. 1.17 PCR 전용 Eppendorf 튜브: 1.5 ml 및 0.5 ml.

4. 1.18 필터 타입 툴.

4. 2 프라이머 및 화학물질

4. 2.1 프라이머 흰 반점 증후군 바이러스(WSSV)를 검출하기 위한 두 단계 PCR 기술에 사용되는 프라이머는 상방 프라이머 (146F1, 146F2)와 하방 프라이머 (146R1, 146R2)로 구성되며, SalI 146 DNA 서열에서 설계되었다. 프라이머의 구체적인 서열은 다음과 같다: 146F1: 5' ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3' (상방 프라이머); 146R1: 5'TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3' (하방 프라이머); 146F2: 5'GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3' (상방 프라이머); 146R2: 5' TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3' (하방 프라이머). 분석에 사용되는 프라이머의 농도는 TBE 버퍼에 25 mM로 희석된다. TBE 버퍼의 구성은 다음과 같다: 10 mM Tris-HCl (pH = 8.0) 및 1 mM EDTA.

4. 2.2 화학물질

4. 2.2.1 DNA 추출 용액: sodium dodecyl sulfat - NaOH (SDS - NaOH) NaOH 0,5 N (20 X): 2g NaOH를 100ml 무균 증류수에 녹임. SDS 0,25 % (20 X): 0,25g SDS를 100ml 무균 증류수에 녹임 (sterilization by autoclaving 불가능).

4. 2.2.2 NaOH 0,025 N - SDS 0,0125 % NaOH 0,5 N: 5ml SDS 0,25%, 5ml 무균 증류수를 충분히 혼합하여 100ml로 만든다. 이 용액은 4°C에서 보관한다.

4. 2.2.3 PCR 마스터 믹스: 50ml 증폭 반응에 필요한 PCR 마스터 믹스의 양은 다음과 같다: Taq DNA Polymerase: 1,25 단위 Tris-HCl (pH = 8,8 at 25°C): 75 mM (NH4)2SO4: 20 mM MgCl2: 1,5 mM dATP, dCTP, d GTP 및 dTTP: 각각 0,2 mM

4. 2.2.4 fX174/HaeIII DNA ladder

4. 2.2.3 마스터 믹스: 50ml 증폭 반응에 필요한 PCR 마스터 믹스는 다음과 같습니다: Taq DNA 폴리머라제: 1.25 유닛 Tris-HCl (pH = 8.8, 25°C): 75 mM (NH4)2SO4: 20 mM MgCl2: 1.5 mM dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP: 각각 0.2 mM

4. 2.2.4 fX174/HaeIII DNA 레퍼런스 스케일

4. 2.2.5 TBE 용액 (트리스-부르릭산-에디타이트) 에디타이트 (에틸렌디아민테트라酢酸) 0,5M: 93,05g 에디타이트를 350ml의 수돗물에 녹여 pH를 8로 조정한 후 나트륨수산화물로 pH를 맞추고, 그 다음 정제수를 추가하여 총 500ml가 되도록 한다. 무균 살균하고 실온에서 보관한다. TBE 1X: 트리스: 108g 부르릭산: 55g 에디타이트 0,5M: 40ml 10X 용액을 제조하기 위해 트리스 108g과 부르릭산 55g을 약 600ml의 수돗물에 녹이고, 그 다음 에디타이트 0,5M 40ml를 추가한 후 정제수를 더하여 총 1L가 되도록 한다. 실온에서 보관하며 사용 시 정제수로 희석하여 1X 용액을 만든다.

4. 2.2.6 TBE 용액에 1% 아가로즈

4. 2.2.7 샘플 로딩 용액 (브로모페놀 블루와 글리세롤) 6X: 브로모페놀 블루 0,25%, 글리세롤 40%

4. 2.2.8 에티디움 브로마이드 용액 (10mg/ml) 5 샘플 준비 5.1 샘플의 양

5. 1.1 포스트 라빌라레 (후 유충) 샘플에 대해 각 반응에 필요한 샘플 양은 원래 상태의 100개 개체이다.

5. 1.2 부모 새우 샘플에 대해 각 반응에 필요한 샘플 양은 새우 날개 또는 눈 줄기 또는 수영 다리에서 추출한 100mg이다.

5. 1.3 상업용 새우 샘플에 대해 각 반응에 필요한 샘플 양은 새우 날개에서 추출한 100mg이다. 상업용 새우 샘플은 두 가지 경우에서 추출된다:

a. 병원성 새우가 있는 연못에서는 가장 명확한 병변을 보이는 10-20마리를 추출해야 한다.

b. 정상적으로 성장하거나 병변 징후가 없는 연못에서는 무작위로 20-30마리를 추출해야 한다.

5. 2 분석을 위한 샘플 요구사항 샘플은 살아있는 상태에서 채취되어 즉시 95% 에탄올에 보관되어야 한다. 보관용 에탄올의 부피는 분석할 샘플의 부피보다 최소 3배 이상이어야 한다. 고정 후 샘플은 약 25-30℃에서 1주일 동안 보관되며, 장기 보관을 위해서는 새로운 에탄올을 교체해야 한다. 6 방법 진행

6. 1 샘플 처리

6. 1.1 샘플은 무균 분쇄기(4.1.1)에서 900ml의 DNA 추출 용액(4.2.2.1)과 함께 분쇄되고, 분쇄된 용액은 1.5ml의 이프포르트(4.1.17)에 담겨 약 5-10분간 물 끓는 온도에서 가열 변성시키고 빠르게 식히기 위해 얼음물에 넣는다.

6. 1.2 분쇄 용액을 5분간 13,000rpm으로 센터피시어(4.1.5)에서 원심분리하고, 상층액을 PCR 반응에 사용한다. 즉시 분석하지 않는다면 샘플은 -20℃에서 1주일 동안 보관해야 한다.

6. 2 PCR 확대 반응 PCR 반응은 WSSV 유전자 일부를 특이적으로 증폭하는 두 단계로 이루어진다. 첫 번째 단계는 146F1, 146R1 프라이머 쌍을 사용하여 1441bp 길이의 제품을 생성하고, 두 번째 단계는 146F2, 146R2 프라이머 쌍을 사용하여 941bp 길이의 증폭 제품을 생성한다.

6. 2.1 첫 번째 증폭 단계 50ml의 첫 번째 PCR 반응 조성물은 다음과 같다:

6. 2.1.1 시료에 대한: PCR 마스터 믹스 46ml를 0.2ml 이프포르트에 넣고, 146F1 및 146R1 프라이머(25mM, 4.2.1) 1ml와 분석 대상 샘플에서 얻은 DNA 추출물(6.1.2 참조) 2ml를 추가한다.

6. 2.1.2 양성 대조 샘플: 분석 대상 샘플에서 얻은 DNA 추출물을 이미 알려진 백색점병 샘플의 DNA 추출물로 대체한다.

6. 2.1.3 음성 대조 샘플: 분석 대상 샘플에서 얻은 DNA 추출물을 무균 정제수로 대체한다.

6. 2.2 두 번째 증폭 단계 PCR 마스터 믹스 46ml를 0.2ml 이프포르트에 넣고, 146F2 및 146R2 프라이머(25mM, 4.2.1) 1ml와 첫 번째 증폭 제품 2ml를 추가한다. 두 단계 모두 PCR 반응은 템퍼링 머신(4.1.6)에서 수행되며, 동일한 반응 프로그램으로 설정된다. 반응 프로그램: 94℃에서 4분(1주기), 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분(39주기), 72℃에서 2분(1주기), 4℃에서 분석까지 유지. 두 번째 증폭 제품은 바로 1% 아가로즈 젤(4.2.2.6)에 전하되어 전기영동을 실시하며, 아가로즈 젤에는 에티디움 브로마이드(4.2.2.8)가 포함되어 있다.

6. 3 전기영동 수행

6. 3.1 1% 아가로즈 젤 준비 1% 아가로즈는 TBE 1X 용액(4.2.2.5)에 녹인다. 완전히 녹인 후, 약 60℃까지 식힌 후 에티디움 브로마이드 용액(4.2.2.8) 5ml와 아가로즈(4.2.2.6) 100ml를 추가한다. 아가로즈 젤은 미리 준비된 주형에 넣고, 전기영동 젤의 두께는 약 3-4mm가 되어야 한다. 준비된 젤은 TBE 1X 용액에 담근다.

6. 3.2 전기영동 침전기 침전기는 TBE 1X 용액(4.2.2.5)을 담고 있다.

6. 3.3 전기영동 10ml의 증폭 제품(6.2)과 2ml의 샘플 로딩 용액(4.2.2.7)을 혼합한 후, 그 혼합물을 젤 웰에 넣는다. 100V의 전압과 50mA의 전류로 30분간 전기영동을 실시한다. 7 결과 해석 결과는 UV 광선(302nm)을 이용한 판독기에서 읽는다. WSSV의 특이적인 증폭 제품은 첫 번째 단계에서 1441bp, 두 번째 단계에서 941bp이다. DNA 표준 척도를 기준으로, WSSV에 대한 샘플이 양성인지 음성인지 판단한다.

8. 1 에티디움 브로마이드 염색제는 사람과 동물에게 암을 유발할 수 있는 독성 물질이므로, 이를 사용할 때는 장갑과 안경을 착용해야 하며, 사용 후의 용액은 활성탄으로 처리한 후 버려야 한다.

8. 2 UV 광선을 사용하여 결과를 관찰하기 전에 보호 안경을 착용해야 한다.

8. 3 증폭 후 제품과 관련된 모든 도구는 샘플 준비 과정에서 사용되지 않아야 한다.

8. 4 실험실은 증폭 전 샘플 준비 공간과 증폭 후 제품 처리 공간을 분리하여 교차 오염으로 인한 잘못된 양성 결과를 방지해야 한다.