决定第04/2004/QĐ-BTS号关于颁布行业标准

决定

关于颁布行业标准事项

 

农业部部长

根据二零零三年五月二日国务院第43/2003/NĐ-CP号法令关于渔业部的职能、任务、权限和组织结构的规定；

根据科学技术司司长的提议

 

决定：

本通知附带制定地质基础调查、矿产地质调查和矿产勘查钻探工程经济和技术定额。 现发布以下行业标准：

28 TCN 202: 2004 利用聚合酶链反应技术诊断对虾白斑综合征病毒病的方法

条 2. 上述标准鼓励在全国范围内的水产疾病检测检验机构采用，并自公布之日起十五日后生效。

条 3. 部办公厅主任；各司、局、监察部负责人；直属单位负责人；各省水产局、农业与农村发展厅负责水产业管理的局长；根据第二条规定进行水产疾病检测检验的机构和其他相关单位应负责执行本决定。

                                                28 TCN202:2004:

聚合酶链反应技术诊断对虾白斑综合征病毒病方法
                                            Polymerase Chain Reaction

一、适用对象和范围

1.1 本程序规定了利用聚合酶链反应（以下简称PCR）技术检测引起白斑综合征（以下简称白斑病毒病）病毒的过程和内容。

1.2 本程序用于通过PCR技术对对虾亲虾、种虾、商品养殖对虾等对虾白斑病毒病的诊断。也可使用本程序对其他甲壳类动物进行白斑病毒病的诊断。2 参考文献

2.1 Lightner D.V. (Ed.) (1996). 对虾病理学和诊断程序手册。世界水产养殖学会，美国路易斯安那州巴吞鲁日。

2.2 Lo C.F., Ho C.H., Peng S.E., Chen C.H., Hsu H.C., Chiu Y.L., Chang C.F., Liu K.F., Su M.S., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). 在养殖和捕获的虾、蟹及其他节肢动物中发现白点综合症杆状病毒（WSBV）。《水生生物疾病》杂志，27卷，215-225页。

S. ，王C.

H. &寇G.

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2.3 Lo C.F., Leu J.H., Ho C.H., Chen C.H., Peng S.E., Chen Y.T., Chou C.M., Yeh P.Y., Huang C.J., Chou H.Y., Wang C.H. & Kou G.H. (1996). 使用聚合酶链反应技术检测对虾中的白点综合症杆状病毒（WSBV）。《水生生物疾病》杂志，25卷，133-141页。

2.4 Newton C.R. and Graham A. (1994). 聚合酶链反应。奥尔登出版社，英国牛津。

3.1 聚合酶链反应（PCR）技术是一种使用一系列连续反应扩增目标DNA序列数量的技术，通过变性、引物退火和DNA聚合酶合成新链三个步骤完成。

3.2 DNA聚合酶是合成新DNA链的酶，可以从模板链合成新的DNA链，参与复制过程。

3.3 bp（碱基对）是指双链DNA分子上的A-T或C-G配对，是测量DNA长度的基本单位。

3.4 引物是一段短的DNA序列，可以与模板DNA链上的自由3'-OH端结合，帮助DNA聚合酶开始合成新链。

3.5 正向引物和反向引物：按照反向转录的方向理解。

3.6 变性是指DNA从双链状态变为单链状态的过程，通常由热引发。

3.7 对虾鳃片是由许多鳃丝组成的结构，主要功能是呼吸。

4 设备、工具、引物和化学试剂

4.1 设备、工具

4.1.1 无菌样品研磨器。

4.1.2 样品混合机。

4.1.3 磁力搅拌器。

4.1.4 蒸馏水制备器。

4.1.5 离心机（速度不低于每分钟13000转）。

4.1.6 温度循环仪。

4.1.7 电泳装置包括电源和水平电泳槽。

4.1.8 带有紫外灯（波长302nm）的结果读取台。

4.1.9 结果拍照装置。

4.1.10 温度为-20°C或更低的冰箱。

4.1.11 温度为4°C的冰箱。

4.1.12 无菌操作台。

4.1.13 工具干燥箱。

4.1.14 微波炉。

4.1.15 分析天平（精度至0.001g）。

4.1.16 各种移液管：1-5ml、5-10ml、20-100ml和100-1000ml。

4.1.17 专用于PCR的Eppendorf管：1.5ml和0.5ml。

4.1.18 过滤吸头。

4.2 引物、化学试剂

4.2.1 引物 白斑综合征病毒（WSSV）特异性引物用于两步PCR技术，包括正向引物（146F1、146F2）和反向引物（146R1、146R2），设计基于SalI 146 DNA序列。具体引物序列如下：146F1: 5' ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3'（正向引物）；146R1: 5'TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG A 3'（反向引物）；146F2: 5'GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3'（正向引物）；146R2: 5' TAC GGC AGC TGC TGC ACC TTG T 3'（反向引物）。用于分析的引物浓度在TBE缓冲液中稀释至25 mM。TBE缓冲液成分如下：10 mM Tris-HCl（pH = 8.0）和1 mM EDTA。

4.2.2 化学试剂

4.2.2.1 DNA提取溶液：十二烷基硫酸钠-NaOH（SDS-NaOH）NaOH 0.5 N（20倍浓缩液）：将2克NaOH溶解于100毫升无菌蒸馏水中。SDS 0.25%（20倍浓缩液）：将0.25克SDS溶解于100毫升无菌蒸馏水中（不得高压灭菌）。

4.2.2.2 NaOH 0.025 N - SDS 0.0125% NaOH 0.5 N：5毫升SDS 0.25%，5毫升无菌蒸馏水，加至100毫升。保存该溶液在4°C条件下。

4.2.2.3 PCR主混合液：50毫升扩增反应所需的PCR主混合液包括：Taq DNA聚合酶：1.25单位Tris-HCl（pH = 8.8，在25°C下）：75 mM(NH4)2SO4：20 mM MgCl2：1.5 mM dATP、dCTP、dGTP 和dTTP：每种0.2 mM

4.2.2.5 TBE 缓冲液（三羟甲基氨基甲烷-硼酸-EDTA）：EDTA（乙二胺四乙酸）0.5M：将93.05g EDTA溶解于350ml水中，然后用NaOH调节pH至8。之后加入蒸馏水至总体积为500ml。进行高压灭菌并保存在室温下。TBE 1X：三羟甲基氨基甲烷：108g；硼酸：55g；EDTA 0.5M：40ml。配制10倍浓缩液（10X），方法是将108g三羟甲基氨基甲烷和55g硼酸溶解于约600ml水中。然后加入40ml EDTA 0.5M，并用水定容至1L。保存在室温下。使用时，用无菌蒸馏水稀释成1X溶液。

4.2.2.6 1% 琼脂糖溶液在TBE缓冲液中

4.2.2.7 样品加载溶液（溴酚蓝和甘油）6X：溴酚蓝0.25%，甘油40%

4.2.2.8 溴化乙锭溶液（10mg/ml）5 样品准备 5.1 样品数量

5.1.1 对于后幼体虾样品（postlarvae），每个反应所需的样品量为100个个体，整只取样。

5.1.2 对于亲虾样品，每个反应所需的样品量为100mg，从附肢或眼柄或游泳足处取样。

5.1.3 对于商品虾样品，每个反应所需的样品量为100mg，从附肢处取样。商品虾样品的采集分为两种情况：

a. 如果池塘中有患病虾，必须采集10-20只症状最明显的虾。

b. 如果池塘中的虾正常生长且未见病状，则需随机采集20-30只虾。

5.2 样品分析要求 样品应在活虾状态下采集，并立即保存在95%酒精中。用于保存的酒精体积应不少于所需分析样品体积的3倍。固定后，样品应在约25-30°C的温度下保存一周。如需长期保存，须更换新鲜酒精。6 实验步骤

6.1 样品处理

6.1.1 样品在无菌研磨器（4.1.1）中与900ml DNA提取液（4.2.2.1）一起研磨。研磨后的溶液转移到1.5ml Eppendorf管（4.1.17）中，通过沸水浴加热5-10分钟变性，然后迅速冷却至冰水。

6.1.2 使用离心机（4.1.5）以13000转/分钟的速度离心5分钟。随后收集上清液用于PCR反应。如果样品不能立即分析，应将其在-20°C下保存一周。

6.2 PCR扩增反应 反应包括两次特异性扩增WSSV基因片段，基于特定引物对（4.2.1）。使用引物对146F1、146R1进行第一次扩增，产物长度为1441bp，使用引物对146F2、146R2进行第二次扩增，产物长度为941bp。

6.2.1 第一次扩增步骤 50μl PCR反应体系如下：

6.2.1.1 对于测试样品：吸取46μl PCR主混合液到0.2ml Eppendorf管中，加入1μl浓度为25mM的引物146F1和146R1（4.2.1），以及2μl从需要分析的样品中获得的DNA提取液（根据6.1.2条）。

6.2.1.2 阳性对照样品：用已知白斑病样品的DNA提取液代替需要分析样品的DNA提取液。

6.2.1.3 阴性对照样品：用无菌蒸馏水代替需要分析样品的DNA提取液。

6.2.2 第二次扩增步骤 吸取46μl PCR主混合液到0.2ml Eppendorf管中，加入1μl浓度为25mM的引物146F2和146R2（4.2.1），以及2μl第一次扩增产物。整个PCR扩增反应在热循环仪（4.1.6）上进行，设置相同的反应程序。扩增反应程序：94°C 4分钟（1周期）；94°C 1分钟；55°C 1分钟；72°C 2分钟（39周期）；72°C 2分钟（1周期）；4°C直至分析。第二次扩增产物立即在含有溴化乙锭（4.2.2.8）的1%琼脂糖凝胶（4.2.2.6）上电泳。

6.3 电泳操作

6.3.1 准备1%琼脂糖凝胶 琼脂糖在1XTBE缓冲液（4.2.2.5）中溶解。完全融化后，冷却至约60°C，加入5ml溴化乙锭溶液（4.2.2.8）和100ml琼脂糖（4.2.2.6）。将琼脂糖倒入带有梳子的模具中形成井。电泳凝胶厚度约为3-4mm。制备好的凝胶必须浸泡在1XTBE缓冲液中。

6.3.2 电泳槽 电泳槽内装有1XTBE缓冲液（4.2.2.5）。

6.3.3 电泳 将10ml扩增产物（6.2）与2ml样品加载溶液（4.2.2.7）混合，然后注入凝胶井中。在100V电压和50mA电流下电泳30分钟。

7 结果读取 结果在紫外灯（波长302nm）下读取。WSSV的特异性扩增产物在第一步为1441bp，在第二步为941bp。根据DNA标准尺，样品依据第一步和第二步的特异性扩增产物确定是否为WSSV阳性或阴性。8 安全规定 在操作过程中必须遵守以下规定：

8.1 溴化乙锭是一种对人体和动物可能致癌的有毒物质。因此，在使用该化学物质时必须佩戴手套和护目镜。使用后的溶液必须通过活性炭过滤后再排放。

8.2 仅在佩戴防护眼镜的情况下才能开启紫外线灯观察结果。

8.3 严禁使用与扩增产物相关的工具来准备样品。