결정 제 54/2000/QĐ-BNNPTNT/KHCN 농업 미생물 유전자원의 액체 질소 보존 방법에 관한 산업 분야 기준을 고시함

 

결정

농업생물자원 장기 보존 방법에 관한 산업 기준을 제정함

농업용 미생물 유전자원의 액체 질소 보존 방법 (10TCN: 416-2000)

농림수산부 장관

정부가 1995년 11월 1일 제73/CP号政令，关于农业和农村发展部职能、任务、权限和组织结构的规定；

정부령 제86/CP호 1995년 12월 8일에 따른 국가품질관리책임분담 규정에 의거

과학기술과 제품품질 부국장의 건의를 검토함

결정

조 1: 이제 다음과 같은 산업 기준을 공포한다:

10TCN: 416-2000 농업용 미생물 유전자원의 액체 질소 보존 방법은 총 3절 13호로 구성됨

조항 2: 이 결정은 서명 날짜로부터 15일 후 효력을 발생한다.

조항 3: 사무총장, 과학기술 및 제품품질과 장관, 관련 기관 및 개인은 본 결정을 이행할 책임이 있음

농업용 미생물 유전자원의 액체 질소 보존 방법 10TCN 416-2000

기술 요구사항

하노이 - 2000

편찬기관: 미생물학과

제정기관 요청: 농업과학기술원

베트남 농업과학기술원

검토기관: 과학기술부 및 표준화정책국

제정기관: 농업부 및 농촌개발부

함께 첨부된 결정 번호: /2000-QĐ/BNN-KHCN

2000년 월 일

 

기준

농업용 미생물 유전자원의 액체 질소 보존 방법 10TCN 416-2000
(2000년 월 일에 따른 결정 번호: 2000/QĐ-BNN-KHCN)

1. 적용 범위:

이 기준은 농업용 호기성 및 저산소성 미생물(동물의 분야를 제외한 것)의 세포와 포자 형태의 장기 보존을 위해 무균 상태에서 액체 질소를 사용하는 방법에 적용된다.

2. 용어 및 정의:

2.1. 농업용 미생물: 농업 연구 및 이용을 목적으로 하는 다양한 세균, 방사균, 청색박테리아, 효모, 균류로, 농업부 및 농촌개발부의 승인을 받은 것이다.

2.2. 미생물 보존: 선택된 순수한 종자를 적절한 조건에서 보관하여 생존율을 유지하고 원래 특성을 보존한다.

2.3. 장기 보존: 2년 이상 보관하는 것을 의미한다.

2.4. 생물학적 특성: 미생물의 활동을 통해 작물 또는 동물의 성장, 발달, 생물학적 및 생태학적 환경 관리를 촉진하는 능력이다.

2.5. 선별 배양액: 특정 종이나 그룹의 미생물만이 성장할 수 있는 배양액이다.

2.6. 차별 진단 배양액(지시 배양액): 다른 종의 미생물을 빠르게 구별할 수 있는 배양액이다.

2.7. 종자: 저자나 유전적으로 안정된 유전자은행에서 수집, 선택, 교배하거나 얻은 것이다.

2.8. 배양 간격: 미생물의 특성을 유지하기 위한 두 배양 사이의 시간이다.

2.9. 종자 생존율: 보관된 종자의 생존 세포 수가 처음 배양된 종자의 생존 세포 수 대비 백분율이다.

2.10. 종자 복구: 보관된 미생물을 적절한 영양 배양액으로 옮겨 원래의 특성을 회복하는 과정이다.

3. 내용:

3.1. 장비:

- 건조 소독기와 습식 소독기

- 온실

- 무균 배양기

- 초저온 냉장고

- 액체 질소를 포함한 미생물 샘플 용기

- 액체 질소 저장 용기

- 폴리올레핀 장갑

- 2ml 크기의 저온 내성 폴리프로필렌 튜브 또는 중성 유리 아밀

- 정밀도 0.01g까지의 척도

- 배양 도구

- 유리 스케치 도구

- 유리 튜브

- 측정 컵

- 삼각병

- 피트리 접시

- 분량 주입기, 분량기

- 알코올램프 또는 가스램프

3.2. 절차:

3.2.1. 도구 준비:

- 미생물을 확인하는 도구는 다음 방법 중 하나로 소독해야 한다:

+ 160 - 175°C에서 2시간 이상 건조 소독기에서⁰+ 1atmotphe (121°C)에서 20분 이상 습식 소독기에서

- 폴리프로필렌 튜브(또는 아밀) 준비: 2% 염산 용액에 12시간 담가서 물로 3-4회 씻어내고 증류수로 다시 닦아내고 1atmotphe (121°C)에서 15분간 습식 소독기에서 소독한다.⁰3.2.2. 배양액 준비:

- 생체량 배양 및 종자 생존율 확인을 위한 배양액은 선택 배양액(목 2.5)이다.⁰3.2.2. 배양액 준비:

각 배양액 성분을 증류수에 첨가하고 분배한 후 적절한 조건에서 소독한다.

- 보호 배양액: 분유 10%(w/v), 또는 글리세롤 10%(v/v), 또는 DMSO 5%(v/v)를 포함한다. 보호 배양액은 파스퇴르 소독법, 필터 소독법, 또는 121°C에서 15분간 소독한다.

3.2.3. 종자 준비:

- 종자 재료는 최소 세 번 이상 반복 샘플을 가져야 한다.⁰- 배양 전환 시 개별 균집을 선택해서는 안 된다(성장 변이를 피하기 위함).

- 샘플링은 순수한 샘플을 확보하도록 수행되어야 한다. 샘플링자는 샘플링 경험이 있어야 한다.

- 샘플링, 운송 및 처리는 외부 오염을 피하고 원래 상태를 유지해야 한다.

3.2.4. 현탁액 준비: 두 가지 방법으로

3.2.4.1. 기울이는 배양액에서 현탁액 준비:

적절한 배양액에서 미생물을 배양한다. 세포가 잘 성장하고 안정화되면, 현탁액을 준비한다.

무균 주입기를 사용하여 10% (v/v) 글리세롤 또는 5% (v/v) DMSO 또는 10% (w/v) 분유를 포함한 5ml 영양액을 각 기울이는 배양액에 넣는다.

무균 도구를 사용하여 기울이는 배양액 표면의 모든 생체량을 영양액에 녹이고, 전체 현탁액 세포를 주입기에 분배한다. 세포 밀도는 최소 10

세포/ml이어야 한다.

무균 주입기를 사용하여 현탁액 세포 1ml를 폴리프로필렌 튜브에 넣고 꼭짓점을 단단히 돌려 잠근다. 유리 아밀을 사용할 수도 있으며, 아밀 머리 부분은 가스램프로 고정한다. 현탁액 세포를 폴리프로필렌 튜브 또는 아밀의 가장자리나 내벽에 묻히지 않도록 주의해야 한다.

무균 주입기를 사용하여 현탁액 세포 1ml를 폴리프로필렌 튜브에 넣고 꼭짓점을 단단히 돌려 잠근다. 유리 아밀을 사용할 수도 있으며, 아밀 머리 부분은 가스램프로 고정한다. 현탁액 세포를 폴리프로필렌 튜브 또는 아밀의 가장자리나 내벽에 묻히지 않도록 주의해야 한다.

아밀을 5°C에서 30분간 냉장고에 보관하여 세포와 배양액 사이의 안정성을 확보한다.⁸ 3.2.4.2. 액체 배양액에서 현탁액 준비:

적절한 액체 배양액에서 미생물을 배양한다. 세포가 잘 성장하고 안정화되면, 액체 질소를 사용하여 보존한다.

앰플을 5℃ 냉장고에 30분 동안 보관하여 세포와 환경 사이의 안정성을 달성한다.⁰C를 30분 동안 5℃ 냉장고에 보관하여 세포와 환경 사이의 안정성을 달성하기 위해.

3.2.4.2. 액체 미디엄에서 배양된 모본을 이용한 현탁액 준비:

모본은 적절한 액체 미디엄에서 배양된다. 세포가 잘 성장하고 안정화되면 액체 질소 보존을 실시한다.

무균 피펫을 사용하여 미생물 용액의 체적에 따라 20%(v/v)의 글리세롤 또는 10%(v/v)의 DMSO 또는 20%의 살균된 분유(체중비)를 체적으로 추가하여 최종 글리세롤 농도가 10%(v/v) 또는 DMSO가 5%(v/v) 또는 분유가 10%(w/v)가 되도록 한다.

가볍게 흔들어 세포 현탁액을 균일하게 하여 세포 밀도가 최소 10⁸ 세포/mL이 되도록 한다. 만약 미생물 종이 작은 점이나 큰 군집으로 자라면, 세포 분쇄기나 무균 세라믹 분쇄기를 사용하여 분쇄할 수 있다.

적절한 액체 배양액에서 미생물을 배양한다. 세포가 잘 성장하고 안정화되면, 액체 질소를 사용하여 보존한다.

앰플을 5℃ 냉장고에 30분 동안 보관하여 세포와 환경 사이의 안정성을 달성한다.⁰C를 30분 동안 5℃ 냉장고에 보관하여 세포와 환경 사이의 안정성을 달성하기 위해.

3.2.5. 액체 질소 보관 과정: 다음과 같이 수행된다:

폴리프로필렌 시험관(암풀)을 알루미늄 트레이에 넣은 후 냉각실에서 냉각기에 넣는다.

냉각 속도를 1-2⁰℃/분으로 조정하여 -30⁰℃까지 냉각한다. 그 다음 냉각 속도를 1⁰℃/분으로 조정하여 -50⁰

℃ 이하까지 냉각한다. 그런 다음 폴리프로필렌 시험관(암풀)을 액체 질소 저장 용기(보관 온도 -156⁰℃에서 -196⁰℃)로 신속히 이동시킨다.

주석: 작업 시 폴리올레핀 장갑을 착용하여 화상을 방지해야 한다.

3.3. 종 검사:

종의 생존율과 생물학적 특성을 정기적으로 연간 검사하고, 원래 종과 동일한 생존율과 안정적인 생물학적 활성만 유지하도록 한다.

3.3.1. 생존율 검사:

3.3.1.1. 검사 환경:

선택 배양 환경을 사용하여 검사를 실시한다. 화학 물질 성분 순서대로 배양 환경을 제조한 후 준비된 유리 용기로 분배하고 적절한 조건에서 소독한다. 배양 환경을 45-50⁰℃까지 식힌 후 무균 Petri 접시에 분배한다. 이 작업은 무균 조건에서 수행된다.

3.3.1.2. 희석 용액: 질소 화합물을 포함하지 않는 생리식염수(NaCl 0.85%)를 사용하며, 소독 후 pH는 7.0이다.

적절한 용량의 시험관에 희석 용액을 분배하여 소독 후 각 시험관에 9ml가 들어가도록 한다. 멜트와 소독 후 1atmosphere(121⁰℃)에서 30분간 소독한다.

즉시 사용하지 않을 경우, 희석 용액은 4-10⁰℃의 냉장고에서 보관되며, 제조 후 1개월 이내에 보관해야 한다.

주의: 갑작스러운 온도 변화로 인해 미생물에 영향을 미치지 않도록 희석 용액을 실험실 온도로 조정한 후 사용해야 한다.

3.3.1.3. 세포 현탁액(현탁액) 준비:

검사할 보관 종 시험관을 액체 질소 저장 용기에서 꺼내 실험실 온도에서 자연적으로 녹인다.

폴리프로필렌 시험관(암풀) 외부를 70%(v/v) 에탄올로 처리된 무균 천으로 닦아내 특히 시험관 목과 몸통 사이의 부분에 주의한다.

무균 조건에서 폴리프로필렌 시험관(암풀)의 캡을 열고 무균 주사기를 사용하여 시험관 내부의 1ml 현탁액을 9ml의 희석 용액에 혼합한다. 주사기가 희석 용액에 닿지 않도록 주의하고, 무균 피펫을 사용하여 10회 반복하거나 기계적 혼합기를 5-10초 동안 사용하여 잘 섞는다. 이를 반복하여 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7.

배 현탁액을 얻는다.

무균 피펫을 사용하여 희석된 샘플 현탁액에서 0.05ml(1방울)의 샘플을 취하여 준비된 배양 환경을 포함하는 무균 Petri 접시에 배양한다(3.3.1 참조). 각 희석 샘플은 3개의 Petri 접시에 배양되며(각 희석은 다른 무균 피펫을 사용한다).

무균 스크래퍼를 사용하여 Petri 접시 표면의 젤을 고르게 펴고, 젤 표면이 건조될 때까지 기다린 후 접시를 뒤집어 적당한 온도와 시간으로 보온기에서 보관한다.

각 Petri 접시 상의 특정 균락 수를 세운다.

여기서:

A: 1ml 현탁액 당 균락 수

a: 각 Petri 접시의 평균 균락 수

d: 희석 용액의 농도

20: 1ml 현탁액 당 방울 수

주의: 같은 희석에서 배양된 Petri 접시의 평균 균락 수는 30-300개의 균락을 포함하는 접시만 계산한다. 또한 두 개의 연속 희석에서 배양된 Petri 접시의 평균 균락 수는 각 희석의 평균 균락 수를 계산한 후 더 높은 희석의 균락 수를 10배로 곱한 후 두 값의 평균을 계산한다. 만약 두 값의 비율이 2보다 크다면, 작은 값이 결과로 사용된다. 검사 단위당 미생물 밀도는 1.00에서 9.99로 표현되며, n은 적절한 지수이다.^다보관 종 샘플의 세포 밀도

각 종의 생물학적 특성에 따라 특정 방법을 사용하여 수행한다.

각 종 미생물의 생물학적 특성에 따라 구체적인 방법을 따르는다.