本决定发布农业微生物基因资源长期液氮保存方法行业标准，适用于用于农业的异养好氧和微好氧微生物。详细规定了工具准备、培养基、菌种样本、悬液制备、液氮保存及存活率检测程序。
Scope of application
用于农业的异养好氧和微好氧微生物（不包括兽医领域的微生物）。
Key points
- 保存：用于农业的异养好氧和微好氧微生物，不包括兽医领域的微生物。
- 工具准备、培养基制备、菌种样本、悬液制备、液氮保存及存活率检测程序。
- 菌种样本存活率百分比通过将稀释液分配到试管中，充分混合并接种在培养皿上测定。
- 工具必须使用高压灭菌锅或在适当温度下干燥箱进行灭菌。
- 在液氮罐中以-156°C至-196°C的温度保存菌种样本。
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- 积极影响：有助于保护农业微生物基因资源，增强农业研究和应用效果。
- 消极影响：设备和技术投资成本可能给执行组织带来负担。
❓ Frequently asked questions
哪些微生物按照此规定保存？
本规定适用于用于农业的异养好氧和微好氧微生物，但不包括兽医领域的微生物。
工具准备过程如何进行？
工具必须在高压灭菌锅中以1大气压（121°C）灭菌至少20分钟，或在160-175°C的干燥箱中灭菌至少2小时。
菌种样本存活率百分比如何确定？
存活率百分比按公式计算：(菌落形成单位/ml悬液) × 100 / 原始菌种样本细胞密度。
菌种样本保存温度是多少？
菌种样本在液氮罐中以-156°C至-196°C的温度保存。
本规定适用于多长时间的长期保存？
本标准适用于超过两年的长期保存。
Full text
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农业农村部 |
社会主义共和国越南 |
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编号：54/2000/QĐ-BNN-KHCN |
河内，二〇〇〇年五月十五日 |
决定
颁布农业微生物基因长期保存方法行业标准
使用液氮（编号416-2000）
农业农村部部长
根据一九九五年十一月一日国务院令第73号《农业部职能配置、内设机构和人员编制规定》；
根据一九九五年十二月八日政府第86号决定关于商品质量国家管理职责分工的规定。
经审议科技与产品质量司司长的建议
决定
第一条： 现发布以下行业标准：
10TCN: 416-2000 农业微生物基因液氮长期保存方法包括三节十三项。
条2： 本决定自签发之日起十五日后生效。
条3： 办公室主任、科技与产品质量司司长及相关组织和个人负责执行本决定。
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部长签署 副部长 （签字） 吴世民 |
农业微生物基因液氮长期保存方法
技术要求
河内-2000
编制单位：微生物学系
提出单位：科学技术研究院
农业部
审核单位：科技与国际合作司
颁布单位：农业农村部
附属于决定编号： /2000-QĐ/BNN-KHCN
年月日二〇〇〇
标 准
农业微生物基因液氮长期保存方法10TCN 416-2000
（附属于二〇〇〇年决定编号：2000/QĐ-BNN-KHCN年月日二〇〇〇）
第一条 适用范围：
本标准适用于在农业中使用的需氧和微需氧异养微生物的长期保存，这些微生物以细胞或孢子形式，在无菌条件下使用液氮进行保存（不包括兽医领域的微生物）。
2. 术语和定义：
2.1. 农业微生物：指由农业部批准的研究和使用的各种不同类型的细菌、放线菌、蓝细菌、酵母菌和霉菌。
2.2. 微生物保存：是指在适宜条件下保存经过选择的纯种样品，以确保高存活率并保持初始特性。
2.3. 长期保存：指保存样品超过两年的时间。
2.4. 生物特性：指通过其生命活动对作物生长发育、动物饲养、生物控制和生态环境产生影响的能力。
2.5. 选择性培养基：指仅适合特定种类或一组微生物生长繁殖的培养基。
2.6. 鉴别培养基（指示培养基）：指能够快速区分一种微生物与其他微生物的培养基。
2.7. 种子样品：指作者收集、选择、杂交或从遗传稳定基因库中获取的种子。
2.8. 转接时间：指两次转接之间维持微生物特性的间隔时间。
2.9. 种子样品存活百分比：指保存样品中的活细胞数量与最初培养并稳定发展的原始样品中的活细胞数量的比例。
2.10. 种子恢复：指将保存的微生物转移到合适的营养环境中，使其恢复初始特性的过程。
3. 内容：
3.1. 设备：
- 烘箱（干热灭菌设备）和高压锅（湿热灭菌设备）
- 培养箱
- 无菌接种箱
- 深度冷冻箱
- 含有液氮的微生物样品容器
- 液氮储存罐
- 聚乙烯手套
- 耐低温聚丙烯螺口管（2毫升），可消毒或中性玻璃安瓿
- 分析天平，精度至0.01克
- 接种针
- 玻璃刮刀
- 玻璃试管
- 量筒
- 三角烧瓶
- 培养皿（培养盒）
- 移液管，移液器
- 酒精灯或煤气灯
3.2. 操作步骤：
3.2.1. 准备工具：
- 用于鉴定微生物的工具必须采用以下方法之一进行灭菌：
+ 在烘箱中于160-175°C下至少2小时。0+ 在高压锅中于1atmotphe（121°C）下至少20分钟。
- 准备聚丙烯管（或安瓿）：将其浸泡在2%盐酸溶液中12小时。然后用自来水冲洗3-4次，并用蒸馏水冲洗，最后在高压锅中于1atmotphe（121°C）下灭菌。03.2.2. 准备培养基：
- 生长培养基和测定种子样品存活百分比的培养基是选择性培养基（见2.5）。03.2.2. 准备培养基：
按照给定顺序称量并溶解培养基成分于蒸馏水中。将培养基分配到三角烧瓶中。盖上棉塞，根据每种培养基的要求进行适当的灭菌处理。
- 保护培养基：含10%（w/v）脱脂牛奶或10%（v/v）甘油或5%（v/v）二甲亚砜（DMSO）。保护培养基需要通过巴氏杀菌、过滤或在121°C下灭菌15分钟的方法进行灭菌。
3.2.3. 准备种子样品：
- 每个需要保存的样品应准备不少于三次重复样品。0- 不得选择单独的菌落作为转接的种子（避免生长突变）。
- 取样时，取样必须是纯样的。取样人员必须经过培训并具有取样经验。
- 在取样、运输和处理过程中，必须防止外部污染并保持初始状态。
3.2.4. 准备悬浮液：有两种方法
3.2.4.1. 从斜面培养基上的培养样品制备悬浮液：
将样品在合适的斜面培养基上培养。当细胞生长良好且稳定（生长期）时，收集微生物生物质以进行保存。
使用无菌移液管吸取5毫升含有10%（v/v）甘油或5%（v/v）DMSO或10%（w/v）脱脂牛奶的营养培养基（NB）到每个斜面培养基中。
使用无菌工具将斜面上的所有生物质打散到培养基中，然后吸取所有细胞悬浮液，确保细胞密度至少为10
细胞/毫升。
使用无菌移液管将1毫升细胞悬浮液分装到聚丙烯管中，拧紧盖子。也可以使用玻璃安瓿，用火焰封口。不要让微生物液体溅到聚丙烯管或安瓿的边缘或壁上。
使用无菌移液管将1毫升细胞悬浮液分装到聚丙烯管中，拧紧盖子。也可以使用玻璃安瓿，用火焰封口。不要让微生物液体溅到聚丙烯管或安瓿的边缘或壁上。
将安瓿放在58 ℃冰箱中30分钟，以达到细胞和培养基之间的稳定性。
3.2.4.2. 从液体培养基上的培养样品制备悬浮液：
将样品在合适的液体培养基上培养。当细胞生长良好且稳定后，使用液氮进行保存。0在30分钟内达到细胞与环境的稳定。
3.2.4.2. 准备悬浮液培养物样品的液体介质悬液：
样品在适当的液体培养基中培养。当细胞生长良好并稳定后，使用液氮进行保存。
使用无菌移液管补充20%（v/v）甘油或10%（v/v）DMSO或20%脱脂乳（按微生物液体体积计算），以达到最终浓度为10%（v/v）甘油或5%（v/v）DMSO或10%（w/v）脱脂乳。
轻轻摇晃，获得均匀的细胞悬浮液，确保细胞密度至少为10细胞/ml。如果微生物菌落生长成小团或大团，则可以使用小型组织破碎机或无菌研磨器将其破碎。8 细胞/ml。如果微生物菌落形成小颗粒或大团块，则可以使用小型组织匀浆机或无菌研钵将其捣碎。
3.2.4.2. 从液体培养基上的培养样品制备悬浮液：
将样品在合适的液体培养基上培养。当细胞生长良好且稳定后，使用液氮进行保存。0在30分钟内达到细胞与环境的稳定。
3.2.5 液氮保存过程如下：
将聚丙烯试管（安瓿）放入铝盘中，然后放入冷冻机的冷却室。
调整冷却速度至每分钟1-2摄氏度，直到温度降至-30摄氏度。0每分钟C直到温度达到-30°C。0然后继续调整冷却速度至每分钟1摄氏度，直到温度不低于-50摄氏度。0每分钟C直到温度不低于-50°C。0
迅速将聚丙烯试管（安瓿）转移到液氮罐中的最终保存位置（温度从-156摄氏度到-196摄氏度）。0从C到-196°C。0C）。
附随保险代理证书考试登记表附录六a。: 在操作时需佩戴聚乙烯手套，以防烫伤。
3.3 检查菌种：
定期每年检查菌种的存活率和生物学特性。只有那些存活率和生物学活性稳定的菌种才能保留，与原始菌种一致。
3.3.1 检查菌种的存活率：
3.3.1.1 检测环境：
使用选择性培养基作为检测环境。根据提供的成分顺序配制培养基，然后分配到预先准备的玻璃器具中，并在适当条件下灭菌。待培养基冷却至45-50摄氏度后，分配到无菌平皿中。此操作应在无菌条件下进行。0冷却至C然后分装到无菌平皿中。此操作需在无菌条件下进行。
3.3.1.2 稀释液：生理盐水（NaCl 0.85%），不含氮化合物，在灭菌后pH值为7.0。
将稀释液分配到合适容量的试管中，每管含9毫升。用棉塞封口并进行1个大气压（121摄氏度）下30分钟的灭菌处理。0在C下保持30分钟。
如果不立即使用，稀释液应存放在冰箱中，温度为4-10摄氏度，保存时间不超过一个月。0自制备之日起。
注：为了避免因温度骤变对微生物造成影响，在使用前应将稀释液调节至实验室室温。
3.3.1.3 细胞悬液的制备：
从液氮罐中取出需要检查的菌种试管，让冰块自然融化（在实验室条件下）。
用浸有70%（v/v）乙醇的无菌纱布擦拭聚丙烯试管（安瓿）外部，特别是注意管帽和管身之间的区域。
在无菌条件下打开聚丙烯试管（安瓿）的盖子。使用无菌注射器吸取1毫升试管内的细胞悬液，加入9毫升稀释液中，避免注射器接触稀释液。通过无菌移液管上下吸放10次或使用机械搅拌器搅拌5-10秒来充分混合。重复上述步骤，以获得10倍稀释的悬液。-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
接种样品：使用无菌移液管从稀释样品中吸取0.05毫升（一滴）接种到含有已准备好的培养基的无菌平皿中（见3.3.1）。每个稀释度的样品接种到三个无菌平皿中（每个稀释度使用一个无菌移液管）。
使用无菌刮刀均匀涂抹样品液于琼脂表面，等待表面干燥后，将平皿倒置放置在适宜温度和时间的恒温箱中。
计算每个平皿上的典型菌落数量。
每单位检测量（毫升）中的微生物数量按以下公式计算：
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a x 20 |
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A = |
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d |
其中：
A：每毫升悬液中的菌落数
a：每个平皿中的平均菌落数
d：稀释倍数
20：每毫升悬液中的滴数
注：平均菌落数是同一稀释度接种的所有平皿中菌落数的平均值，其中只计算含有30-300个菌落的平皿。平均菌落数也可以通过计算两个连续稀释度接种的平皿的菌落数平均值得出，其中较高稀释度的菌落数乘以10，如果较大值与较小值之比不大于2，则取两者的平均值；如果该比例大于2，则取较小值作为结果。每单位检测量中的微生物数量表示为1.00到9.99乘以10^n，n为适当的指数。||| 农业部门，n为合适的指数。
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保存菌种样本的细胞密度 |
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存活率百分比= |
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× 100 |
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原始菌种样本的细胞密度 |
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3.3.2. 确定生物学特性：
根据每种微生物菌株的具体生物学特性进行确定。
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